針對免疫逃逸的多種腫瘤免疫治療正在研發(fā)中，免疫治療有多個環(huán)節(jié)，遠遠復(fù)雜于靶向治療。細胞免疫從抗原的釋放、捕捉、遞呈和加工，以及到T細胞攻擊等，各個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能導(dǎo)致免疫逃逸。免疫治療最大的進展在于免疫檢查點，腫瘤免疫中，檢查點是負性調(diào)節(jié)，可以使免疫細胞對腫瘤細胞視而不見。免疫治療的前提是腫瘤具有高免疫原性，NSCLC的免疫原性非常好，因此PD-1、PD-L1抑制劑在2015年快速發(fā)展。

　　2016年8月，BMS對外宣布了名為“CheckMate 026”的三期臨床試驗的核心數(shù)據(jù)，在PD-L1表達>5%的NSCLC患者中，Opdivo相比化療，PFS（無進展生存期，4.2對5.9個月）和OS（總生存期，14.4對13.2個月）都沒有顯著提高。反觀默沙東公司的同類藥物Keytruda，在以PD-L1表達>50%的NSCLC患者作為入組指標(biāo)的名為“Keynote024”的臨床試驗中，ORR、PFS甚至OS均完勝，拿下NSCLC一線適應(yīng)癥。因此，BMS股票市值一度跌了20%，BMS的損失成就了競爭對手的市值增長。BMS公司以慘痛的代價教育后來者，PD-L1表達>5%不是一個好的指標(biāo)。

　　據(jù)AACR2017大會最新報告，研究人員采用TMB（腫瘤突變負荷）作為標(biāo)志物對CheckMate026三期臨床試驗進行回顧性研究，結(jié)果顯示，相比PD-L1，選擇TMB作為Opdivo治療NSCLC的biomarker，能更好地區(qū)分獲益人群。該研究發(fā)現(xiàn)，在TMB高表達的病人中，采用Opdivo進行治療后，ORR（客觀緩解率47%vs. 28%）和PFS（無進展生存期，9.7月vs.5.8月）結(jié)果顯著優(yōu)于化療，這一結(jié)果為BMS公司的Opdivo藥物作為NSCLC一線用藥帶來新希望。可以預(yù)見，未來將有更多藥企會考慮將TMB納入ICIs藥物臨床試驗的檢測范圍。

　　精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)始于靶向治療，免疫治療一開始就思考能否利用靶向治療的成功之路。在過去，NSCLC只是一種類型的疾病，人們是基于組織學(xué)進行化療和生物制劑的選擇。現(xiàn)在，根據(jù)腫瘤生物學(xué)特征，基于分子分型，進行個體化的精準(zhǔn)靶向治療。

　　現(xiàn)在，有人提出免疫治療2.0時代，即免疫治療從過去比較粗放的治療，到現(xiàn)在基于免疫檢查點的單克隆抗體阻斷治療，這比過去有了巨大的飛躍和進步。基于PD-1/PD-L1抑制劑的免疫檢查點還有很多需要探索，包括CD8+T細胞亞群的檢測是否與療效、預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在其他腫瘤中腫瘤突變負荷與療效、預(yù)后相關(guān)。

　　1、PD-L1

　　首先我們先了解一下什么是PD-L1，PD-L1是一種表達于細胞表面的蛋白，又稱B7-H1蛋白，是由CD274基因編輯表達。它可以與效應(yīng)T細胞上的PD-1及B7.1結(jié)合，傳導(dǎo)免疫抑制信號，抑制免疫效應(yīng)T細胞的活性。PD-L1在許多類型的細胞中表達，包括胎盤、血管內(nèi)皮細胞、胰島細胞、肌肉、肝細胞、上皮細胞、間充質(zhì)干細胞，以及B細胞，T細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞，肥大細胞。而PD-L1在腫瘤細胞表面的表達則成為了腫瘤逃脫免疫細胞追殺造成腫瘤生長的驅(qū)動因素。

　　PD-L1在腫瘤細胞的表達機制有兩種，組成性廣泛（固有）表達和適應(yīng)性聚焦表達。固有表達是因為致癌基因信號通路改變引起的PD-L1的組成性表達，表達恒定。適應(yīng)性聚焦表達是在免疫細胞分泌的促炎癥因子如IFN-γ的作用下表達，是動態(tài)變化的。這兩種表達機制不排斥，PD-L1的固有表達可在炎癥因子作用下表達上調(diào)。

　　基于以上機理， PD-L1的檢測是基于細胞蛋白水平的檢測，因此臨床試驗中以免疫組化方法為主。也就是大家在手術(shù)或穿刺后取得的腫瘤組織進行切片染色，通常在病理報告中顯示。免疫組化是檢測蛋白表達的經(jīng)典手法，其通過抗體著色后由病理醫(yī)師鏡下觀察根據(jù)著色深淺來評價表達情況。因此除了染色技術(shù)外，抗體的特異性也尤其重要。而目前我國PD-L1檢測比較混亂，一是染色技術(shù)及條件的不統(tǒng)一；二是染色的抗體多樣；三是病理評價標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。這些都導(dǎo)致國內(nèi)患者檢測PD-L1的價值減低。

　　早期研究顯示，PD-L1的表達與PD-L1/PD-1抑制劑的療效相關(guān)，隨著PD-L1表達升高療效增加，疾病控制時間延長，而且預(yù)后改善。

　　1.1 PD-L1檢測的臨床價值

　　截至到目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了4款PD-1/PD-L1抑制劑用于7類不同腫瘤的治療，下表列出批準(zhǔn)的時間和基本適應(yīng)癥（精準(zhǔn)適應(yīng)癥全稱請查閱FDA官方網(wǎng)站）。

　　名稱品類適應(yīng)癥FDA批準(zhǔn)日期備注

　　目前市場上這四種單抗檢測是否具有可比性，是否可以通用？檢測技術(shù)是IHC，一種儀器是Ventana，一種是Dako，而且評價細胞有腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞，因此在評價免疫治療時要考慮單抗藥物、檢測方法、cutoff值等信息。現(xiàn)在，50%高表達僅限于默沙東的檢測方法，至于是否與其他方法通用，目前缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

　　羅氏單抗藥物是Atezolizumab，靶點PD-L1，PD-L1 ICH檢測使用Ventana SP142，評價的細胞是腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞，cutoff值定為1%、5%、50%。III期OAK研究顯示，PD-L1高表達人群傾向于從Atezolizumab治療中獲得更大的OS獲益，而且隨著表達率的增高，獲益更大；在PD-L1陰性亞組中，Atezolizumab相比多西他賽未能提高ORR。

　　施貴寶的Nivolumab靶點PD-1，檢測使用Dako28-8，cutoff值是1%、5%。III期CheckMate057研究顯示，PD-L1的表達水平與非鱗NSCLC患者從Nivolumab治療的OS獲益呈正相關(guān)。III期CheckMate017研究顯示，Nivolumab在鱗癌患者中的療效與PD-L1的表達水平無關(guān)。

　　第三個是Pembrolizumab單抗，靶點PD-1，PD-L1IHC檢測使用Dako 22C3，評價的是腫瘤細胞，cutoff值是1%、50%。III期KEYNOTE010研究顯示，PD-L1高表達人群接受Pembrolizumab治療后死亡風(fēng)險下降更多。PD-L1表達對Pembrolizumab至關(guān)重要，PD-L1強陽性的患者甚至可以一線使用。

　　1.2 如何定義表達率

　　PD-L1檢測受人詬病的地方之一是缺乏標(biāo)準(zhǔn)。已經(jīng)獲批或正在研究中的抗PD-1治療，包括atezolizumab和durvalumab都有自己配套的PD-L1檢測。但問題是，每種檢測所用到的抗體和具體技術(shù)都不同，導(dǎo)致PD-L1陽性的定義只對應(yīng)于藥企自己的標(biāo)準(zhǔn)。比如雖然所有的檢測都分析了腫瘤細胞的PD-L1染色情況，但atezolizumab同時需要評估免疫浸潤細胞的PD-L1狀態(tài)。針對檢測標(biāo)準(zhǔn)的問題，包括國際肺癌研究協(xié)會在內(nèi)的多個國際組織都在努力推進不同PD-L1表達檢測技術(shù)分析，以期能夠提供不同檢測間可靠的精密度對比數(shù)據(jù)。

　　在臨床試驗中， Keytruda及opdivo定義了PD-L1表達的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)，主要以百分比為標(biāo)尺，即在至少有100個腫瘤細胞的癌巢中，表達PD-L1的腫瘤細胞占癌巢腫瘤細胞的比例，因此出現(xiàn)了PD-L1表達的百分比之說。下圖即是PD-L1表達量1%、1%-49%、50%的不同鏡下圖，黃色為著色部位即表達PD-L1的細胞。（ABC為低倍鏡下，DEF為高倍鏡下）。

　　而atezolizumab治療NSCLC的臨床試驗中，他們將檢測點不只局限在腫瘤細胞的PD-L1表達上還同時評價了腫瘤環(huán)境中浸潤的免疫細胞上PD-L1的表達情況，即采用了TC及IC兩個標(biāo)準(zhǔn)，試驗結(jié)束，兩個預(yù)測指標(biāo)對療效都有獨立預(yù)測價值。這主要基于體內(nèi)的免疫細胞如調(diào)節(jié)T細胞也參與了免疫環(huán)境的調(diào)控。這也提示PD-L1的檢測存在很多分歧事宜。

　　1.3 PD-L1檢測的問題與挑戰(zhàn)

　　PD-L1檢測存在的問題有：生物學(xué)方面，如瘤間及瘤內(nèi)異質(zhì)性，干預(yù)治療影響表達，以及細胞類型、染色部位等；檢測技術(shù)方面，如不同的檢測抗體和平臺，不同的閾值；組織來源方面，組織類型，原發(fā)部位與轉(zhuǎn)移灶，細胞學(xué)標(biāo)本，標(biāo)本質(zhì)量等。這些可能會干擾PD-L1的檢測結(jié)果，需要大量臨床研究進行證實。

　　美國AACR、IASLC和4家公司聯(lián)合制定了藍印計劃，目的就是比對四種單抗的檢測結(jié)果。藍印計劃在39個NSCLC標(biāo)本比較4個試劑檢測的結(jié)果，在染色方面，28-8、22C3、SP263顯示出相似的腫瘤細胞陽性染色百分比，SP142染色陽性的腫瘤細胞較少；4種試劑在免疫細胞的染色上一致性較大；在臨床診斷方面，4種試劑完全一致的只占19%。

　　德國的一致性研究顯示，4種試劑在腫瘤細胞染色之間的一致性較高，免疫細胞色一致性較差。

　　AZ比較研究對500例標(biāo)本比較了28-8、SP263和22C3的腫瘤細胞染色，結(jié)果顯示3種試劑之間的一致性較高。

　　2016年ESMO報告了迄今最大樣本量的NSCLC PD-L1檢測數(shù)據(jù)，包括4784例NSCLC，研究得出4項結(jié)論：鱗癌和腺癌的表達分布相似；經(jīng)治和初治人群的表達分布相似；原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移灶的表達分布相似；新鮮標(biāo)本和存檔標(biāo)本的表達分布相似。

　　FDA獲批的PD-1/PD-L1抑制劑對PD-L1的檢測要求，對于不同腫瘤根據(jù)不同的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)批準(zhǔn)，如Nivolumab二線治療無需PD-L1表達檢測，但建議補充診斷，Atezolizumab二線治療也不需要PD-L1表達檢測，Pembrolizumab一線治療PD-L1≥50%，二線治療≥1%。

　　2腫瘤突變負荷

　　從已經(jīng)批準(zhǔn)的適應(yīng)癥和關(guān)鍵臨床研究提供的證據(jù)來看，PD-L1的表達是否可以指導(dǎo)臨床用藥，選擇獲益人群，結(jié)論目前還不一致，這從另外一個側(cè)面提示PD-L1表達還不是一個完美的bio-marker。研究較多的潛在bio-marker 有腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatelliteinstability-high, MSI-H）和錯配基因修復(fù)缺失（mismatch-repair deficiency，MMR），這些潛在的bio-marker又指向一個共同點突變相關(guān)新抗原（mutation-associated neoantigen）。抗CTLA-4在惡性黑色素瘤的研究與抗PD-1在NSCLC的研究進一步說明識別突變相關(guān)新抗原是引起自身抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心要素。

　　2.1背景知識

　　腫瘤突變負荷（TMB）涉及到兩個重要概念germline mutation（種系突變或胚系突變）和somatic mutation（體細胞突變），來自BioNinjia的圖解一目了然地詮釋二者的關(guān)系與區(qū)別。胚系突變來自上一代，可以遺傳，比如血友病，鐮刀細胞貧血等。

　　圖片出處Somatic vs Germline Mutations

　　Somatic突變?yōu)楂@得性突變，在誘變劑的影響下發(fā)生突變，可表現(xiàn)在RNA和蛋白水平，產(chǎn)生的新抗原（或新表位）、蛋白片段、肽段等被自身免疫系統(tǒng)識別為非自我（non-self）抗原，激活T細胞，引起免疫反應(yīng)。

　　體細胞突變可能受到外源性誘變因素的影響，比如肺癌中煙草（吸煙）誘導(dǎo)的C→A的突變。惡性黑色素瘤中，紫外線照射引起的C→T的突變。內(nèi)源性因素引起的突變可以是DNA錯配修復(fù)突變，比如結(jié)直腸癌和食管癌中的MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定）。在實體腫瘤中，95%的突變?yōu)閱蝹�堿基的替換，造成的非同義突變（一個核苷酸突變改變一個蛋白的氨基酸順序），錯義突變（非同義點突變，單個核苷酸改變導(dǎo)致一個密碼子編碼一個不同的氨基酸）和無義突變（非同義點突變使一個密碼子變?yōu)榻K止密碼子引起多肽鏈合成提前終止），共同構(gòu)成了體細胞非同義突變的基本要素。

　　2.2 TMB定義：

　　全基因組中計入胚系DNA變體后體細胞突變數(shù)目。比如Lawrence,MS團隊在Nature上發(fā)表的研究中，將超過100個突變/Mb稱之為高TMB。

　　2.3 臨床研究

　　Tumor Mutation Burden 指導(dǎo)臨床研究并已經(jīng)取得的成果，突變負荷越高，治療應(yīng)答越好，有時腫瘤類型更復(fù)雜、腫瘤突變負荷更高的癌癥患者治療應(yīng)答會更好，這聽起來可能有點不可思議。

　　抗PD1和抗程序性死亡配體（PD-L1）檢查點抑制劑可能有助于激活高腫瘤突變負荷癌癥患者的免疫系統(tǒng)，如果你體內(nèi)存在大量腫瘤新抗原，一旦重新激活你的免疫系統(tǒng)，它就有東西可抗擊。

　　在初始驗證和驗證組（共65名患者），對比治療無響應(yīng)的患者，對治療有響應(yīng)的患者都具有較高的突變負荷。此外，高突變負荷組對比中、低突變負荷組，在客觀反應(yīng)率、無進展生存期和總生存期中均較高。

　　免疫療法應(yīng)答表

　　腫瘤突變負荷免疫療法應(yīng)答率（%）

　　低4

　　中等26

　　高45

　　非常高67

　　2.4 TMB成為bio-marker的優(yōu)點與局限

　　TMB可以橫跨多個腫瘤進行橫向分析；可潛在甄別具體的突變模式和推測新抗原負荷；高覆蓋特點可以檢測出罕見的體細胞突變；高通量分析可以為已知驅(qū)動突變（比如，EGFR,ALK，ROS1等）；TMB可以量化；可以用于選擇IO治療高獲益人群。

　　TMB分析技術(shù)要求高和時間密集；NGS（如全外顯子組測序）價格昂貴，醫(yī)保挑戰(zhàn)；數(shù)據(jù)復(fù)雜需要生物信息學(xué)專家解讀；面臨的NGS技術(shù)挑戰(zhàn)有，石蠟包埋組織DNA/RNA降解；TMB需要有更多的臨床證據(jù)說明與免疫檢查點抑制劑療效之間的關(guān)系；TMB作為潛在的bio-marker，cut off需要定義。

　　總而言之，TMB是潛在的預(yù)測IO療效的bio-marker；NGS（next generation sequencing）可以用于檢測TMB（選項有全基因組測序、全外顯子組測序和選擇性基因測序）；高TMB已經(jīng)被證明與CTLA-4抑制劑治療黑色素瘤和PD-1/PD-L1抑制劑治療黑色素瘤、膀胱癌和NSCLC的臨床療效相關(guān)；TMB作為潛在IO biomarker的臨床研究正在進行中，需要探索與PD-L1表達和腫瘤免疫微環(huán)境因素之間的關(guān)系。

　　2.5 如何檢測腫瘤突變負荷

　　TMB（腫瘤突變負荷）是一項新興的診斷方式，可以幫助預(yù)測免疫治療在某些腫瘤中的響應(yīng)，例如肺癌、膀胱癌和黑色素瘤。

　　美國Foundation和范德寶大學(xué)的合作者已經(jīng)公布了使用TMB的最新數(shù)據(jù)支持，作為foundation one全面的基因組分析的一部分，是全球唯一可以幫助預(yù)測PD-1/L1的治療效果的檢測。這項結(jié)果將會添加到以往的證據(jù)中，來表明患者可以通過TMB預(yù)測免疫治療的獲益程度，這也讓我們更加接近讓最多的患者能從免疫治療中受益的目標(biāo)，為臨床醫(yī)生判定患者是否適合使用PD-1/PD-L1提供依據(jù)。

　　目前，很多臨床研究都顯示，TMB可以預(yù)測免疫治療的療效，如Nivomulab，Pembrolizumab和Atezolizumab。但這些臨床試驗中采用不同的檢測平臺進行TMB檢測，且高TMB的cut-off值也各不相同。今后需要前瞻性的在臨床研究以及臨床實踐中，探索和研究最佳的檢測方法和cut-off值。此外，PD-L1表達目前也是比較成熟的免疫預(yù)測指標(biāo)。TMB與PD-L1如何更好的聯(lián)合應(yīng)用，從而篩選最佳的免疫治療獲益人群，也是未來需要探索的重點。

　　腫瘤的微環(huán)境非常復(fù)雜，涉及到腫瘤細胞、腫瘤微血管、免疫細胞以及腫瘤間質(zhì)等，他們之間的關(guān)系都需要進行明確的相關(guān)性研究，未來需要基于腫瘤微環(huán)境免疫特征的生物標(biāo)記物研究。

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