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時間：2017-10-30 作者：PD1 【轉(zhuǎn)載】 摘 要 程序性細(xì)胞死亡配體-1（PDL1）通常由癌細(xì)胞產(chǎn)生，其通過表達(dá)在T 細(xì)胞上的受體PD1抑制免疫功能。然而，PDL1 和PD1 是否能調(diào)節(jié)疼痛和神經(jīng)元功能并不清楚。本研究顯示黑色素瘤和正常神經(jīng)組織（包括背根神經(jīng)節(jié)，DRG）都能產(chǎn)生PDL1。在正常小鼠足底注射PDL1 后，通過PD1 產(chǎn)生了鎮(zhèn)痛效應(yīng)；而PDL1 中和抗體或其阻斷劑能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生機(jī)械性觸誘發(fā)痛。Pd1 基因敲除的小鼠表現(xiàn)出熱和機(jī)械性痛覺過敏。機(jī)制上，DRG 傷害性神經(jīng)元中的PD1 被PDL1 激活后誘導(dǎo)酪氨酸磷酸酶 (SHP-1) 磷酸化、抑制鈉通道、并激活TREK2 鉀通道從而使神經(jīng)元超極化。PDL1 也能抑制人類DRG 傷害性神經(jīng)元的興奮性。而且，黑色素瘤能產(chǎn)生大量的PDL1，阻斷PDL1 或PD1 能使黑色素瘤小鼠產(chǎn)生自發(fā)性疼痛和觸誘發(fā)痛。本研究揭示了PDL1 作為內(nèi)源性疼痛抑制劑和神經(jīng)調(diào)質(zhì)這一新功能。 研究背景 癌痛極大地?fù)p害了病人的生活質(zhì)量。乳腺癌、肺癌和前列腺癌通常會轉(zhuǎn)移至骨，并通過釋放致痛性物質(zhì)導(dǎo)致骨癌痛。這些物質(zhì)包括質(zhì)子、緩激肽、內(nèi)皮素、前列腺素、蛋白酶、生長因子等，如：神經(jīng)生長因子(NGF) 和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，它們與外周神經(jīng)相互作用導(dǎo)致傷害性神經(jīng)元（傷害性感受器）敏感性和興奮性增加。NGF 和VEGF 還能誘導(dǎo)癌癥部位疼痛傳導(dǎo)神經(jīng)纖維過度生長。盡管腫瘤產(chǎn)生的促疼痛介質(zhì)一直備受關(guān)注，但腫瘤在轉(zhuǎn)移至骨之前，病人通常不會感到疼痛，如黑色素瘤病人在腫瘤轉(zhuǎn)移之前的疼痛就不常見。因此，不同的癌癥，甚至相同的癌癥在不同的生長階段可能會產(chǎn)生不同的疼痛相關(guān)介質(zhì)，這些介質(zhì)能正向或負(fù)向調(diào)節(jié)疼痛敏感性。很多研究顯示，腫瘤（如黑色素瘤）能表達(dá)檢查點(diǎn)抑制蛋白PDL1 (CD274)，并通過受體PD1 抑制T 細(xì)胞功能和誘導(dǎo)免疫耐受。最新抗PD1 和抗PDL1 的免疫治療在癌癥（黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、卵巢癌等）治療方面取得了成功。但PDL1/PD1通路是否或怎樣通過非免疫途徑（如對神經(jīng)元的調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)疼痛敏感性還不清楚。初級傷害性感受器和免疫細(xì)胞具有某些相似性，都能與免疫細(xì)胞相互交流。一方面，傷害性感受器對細(xì)胞因子、趨化因子等免疫介質(zhì)和細(xì)菌感染產(chǎn)生反應(yīng)；另一方面還能表達(dá)細(xì)胞因子、趨化因子和Toll 樣受體(TLRs) 等主要的免疫調(diào)節(jié)劑。初級感覺神經(jīng)元上的TLRs 能通過與離子通道相互作用快速地調(diào)節(jié)疼痛敏感性。在小鼠和人的傷害性神經(jīng)元是否表達(dá)功能性PD1這一重要的免疫調(diào)節(jié)劑還不清楚。本文對此進(jìn)行了研究。研究結(jié)果闡明了DRG 中PDL1/PD1 抑制疼痛的機(jī)制，同時也揭示了黑色素瘤通過表達(dá)PDL1掩蓋疼痛的產(chǎn)生。 主要研究結(jié)果 1. PDL1 抑制急性炎癥性疼痛并提高正常動物的疼痛閾值 足底注射5% 的福爾馬林誘導(dǎo)雙時相的自發(fā)性疼痛。但當(dāng)在足底預(yù)注射PDL1 (1 ～ 10 μg) 時，第二時相的疼痛行為被顯著抑制，而且高劑量（5或10 μg）還能輕度抑制第一時相的疼痛行為。vonFrey 檢測顯示，足底注射PDL1 (5 μg) 能提高正常小鼠對機(jī)械性刺激的縮爪閾值。 2. PDL1 是內(nèi)源性疼痛抑制劑，通過PD1 改變基礎(chǔ)疼痛閾值惡性腫瘤組織能表達(dá)PDL1，在癌癥免疫治療中PD1 可作為預(yù)測性的生物標(biāo)志物。ELISA 檢測顯示小鼠黑色素瘤組織高表達(dá)PDL1（約450 ng/mg）。培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞也能分泌PDL1。對正常組織中的PDL1 的檢測顯示：非神經(jīng)組織，如肝、脾、腎中含較高水平的PDL1（約70 ～ 90 ng/mg）。神經(jīng)組織中，包括腦、脊髓、DRG，PDL1 含量約為50 ng/mg。此外，坐骨神經(jīng)和后爪皮膚中含有少量的PDL1。原位雜交也顯示DRG 神經(jīng)元中表達(dá)Pdl1 mRNA。表明PDL1 在神經(jīng)組織和皮膚中廣泛存在。非惡性腫瘤組織中內(nèi)源性的PDL1 是否參與疼痛調(diào)節(jié)？小鼠足底注射可溶性PD1(sPD1) 中和小鼠后爪中PDL1 后，誘導(dǎo)了短暫的機(jī)械性觸誘發(fā)痛，但沒有出現(xiàn)自發(fā)性疼痛。用PD1 中和抗體RMP1-14 也能誘導(dǎo)出約3 小時的機(jī)械性觸誘發(fā)痛。Nivolumab（也稱為Opdivo）是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的完全人化的IgG4 單克隆抗體，其選擇性作用于PD1。 足底注射nivolumab 能誘導(dǎo)機(jī)械性觸誘發(fā)痛。另外，PDL1 的鎮(zhèn)痛作用可被RMP1-14 和nivolumab 阻斷， 說明PDL1 經(jīng)PD1抑制疼痛。用Pd1 基因敲除小鼠行為檢測顯示：Pd1 基因敲除后基礎(chǔ)疼痛敏感性增加。PDL1 誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)和RMP1-14 誘導(dǎo)的痛覺敏化在Pd1 基因敲除后不再出現(xiàn)。Pd1 基因敲除小鼠DRG 中CGRP，IB4和NF200 表達(dá)正常。這些結(jié)果表明：① PDL1 是內(nèi)源性疼痛抑制物；② PDL1 經(jīng)PD1 產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)，③ Pd1 基因敲除小鼠疼痛敏感性改變不是感覺神經(jīng)元發(fā)育缺陷所致。 3. PDL1 經(jīng)PD1 抑制小鼠DRG 神經(jīng)元的活動原位雜交顯示Pd1 mRNA 在DRG 大中小神經(jīng)元內(nèi)均表達(dá)。免疫組化顯示PD1 蛋白在幾乎所有的DRG 神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)。PD1 免疫陽性信號也存在于CGRP 陽性纖維中。這些結(jié)果說明，外周初級感覺神經(jīng)元能表達(dá)PD1，提示PD1 具有調(diào)節(jié)疼痛的神經(jīng)基礎(chǔ)。 通常激活或敏化傷害性感覺神經(jīng)元（傷害性感受器）誘發(fā)疼痛和痛覺過敏，PDL1/PD1 信號是否通過調(diào)節(jié)傷害性感受器活動來抑制疼痛？作者用全細(xì)胞膜片鉗記錄了分離打散的小鼠DRG 的小型神經(jīng)元的興奮性（直徑 < 25 μm）。結(jié)果顯示：PDL1在非常低濃度時(10 ng/ml) 就能快速抑制動作電位的產(chǎn)生，也能提高基強(qiáng)度（引起動作電位的最小電流強(qiáng)度），PDL1 還能誘導(dǎo)DRG 神經(jīng)元靜息膜電位(RMP) 的超極化效應(yīng)，這些效應(yīng)在Pd1 基因敲除后消失，表明PDL1 經(jīng)PD1 調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性。而且，Pd1 基因敲除后DRG 神經(jīng)元的RMP 和動作電位的發(fā)放頻率增加，表明Pd1 基因敲除小鼠的傷害性感受器興奮性增強(qiáng)。與完全打散的DRG 神經(jīng)元相比，整體DRG 能保留細(xì)胞外隙中的PDL1。在整體DRG 上的實(shí)驗(yàn)顯示，用sPD1 (30 ng/ml) 中和PDL1 后，DRG 小型神經(jīng)元動作電位的放電頻率增加。用nivolumab阻斷PD1 也能增加動作電位頻率。以上研究表明PDL1 和PD1 在調(diào)節(jié)傷害性感覺神經(jīng)元興奮性中非常重要。 4. PDL1 抑制神經(jīng)損傷后DRG 神經(jīng)元的過度 興奮和神經(jīng)病理性疼痛神經(jīng)損傷后初級感覺神經(jīng)元的過度興奮與慢性疼痛密切相關(guān)。在慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷(CCI)誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛小鼠，游離的整體DRG 傷害性神經(jīng)元興奮性增加，這種增加能被PDL1 抑制。而且，鞘內(nèi)注射PDL1 減輕了CCI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏。 5. PDL1 抑制脊髓背角突觸傳遞和損傷誘導(dǎo)的 脊髓神經(jīng)元的過度興奮脊髓薄片的全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示：PDL1能快速降低脊髓II 外層神經(jīng)元自發(fā)性突觸后電流(sEPSCs) 的頻率和振幅。而sPD1 和nivolumab 孵育后增加了脊髓II 外層神經(jīng)元sEPSC 的頻率。PDL1對sEPSC 抑制作用能被nivolumab 阻斷。因此，PDL1/PD1 信號在調(diào)節(jié)脊髓傷害性信息傳遞中發(fā)揮作用。隨后，作者檢測了PDL1 在骨癌痛模型上的中樞作用。骨癌細(xì)胞浸潤2 周后，鞘內(nèi)注射PDL1能減輕骨癌誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛。而且，PDL1減輕了骨癌誘發(fā)的脊髓背角廣動力(WDR) 神經(jīng)元的過度興奮，但nivolumab 卻能增強(qiáng)WDR 神經(jīng)元的活動。這些數(shù)據(jù)顯示PDL1 在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)發(fā)揮作用；在脊髓背角，PDL1/PD1 通過抑制傷害性突觸傳遞和損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)急慢性疼痛。 6. PDL1 經(jīng)SHP-1 調(diào)節(jié)DRG 神經(jīng)元的鈉電流和TREK2 鉀通道 PDL1 如何調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性呢？在免疫細(xì)胞，PD1 被PDL1 激活后募集酪氨酸磷酸酶（SHP-1 和SHP-2）來介導(dǎo)PDL1 的作用。鞘內(nèi)注射PDL1 后DRG 神經(jīng)元SHP-1 被激活，并且它們共存在同一神經(jīng)元內(nèi)。這個激活作用和PDL1 的鎮(zhèn)痛作用可被SHP-1 抑制劑SSG 阻斷。說明DRG神經(jīng)元SHP-1 不僅是PD1 下游信號，而且參與PDL1 鎮(zhèn)痛。DRG 神經(jīng)元鈉通道在動作電位和疼痛中起重要作用，實(shí)驗(yàn)顯示PDL1 能抑制瞬時鈉電流，這種抑制可部分被SSG 阻斷。鉀通道TREK2 能調(diào)節(jié)DRG 傷害性神經(jīng)元RMP。在共表達(dá)PD1 和TREK2 的CHO 細(xì)胞上，PDL1 能使RMP 超極化、增強(qiáng)TREK2 誘導(dǎo)的電流、使反轉(zhuǎn)電位負(fù)移。這些作用能被SSG 阻斷。表明PD1 被PDL1 激活后經(jīng)SHP-1 通過抑制鈉通道和增強(qiáng)TREK2 通道功能來調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。 7. 人類DRG 神經(jīng)元表達(dá)功能性的PD1目前疼痛治療的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)是個難題。進(jìn)一步在人類DRG 神經(jīng)元的研究顯示，人類DRG 神經(jīng)元也表達(dá)PD1。而且PDL1 能抑制人DRG 傷害性神經(jīng)元的興奮性，該抑制作用也能被SSG 阻斷，與小鼠的結(jié)果一致。 8. PDL1 和PD1 能掩蓋黑色素瘤小鼠的自發(fā)性疼痛和觸誘發(fā)痛黑色素瘤表達(dá)大量的PDL1，而且黑色素瘤小鼠沒有癌痛的行為表現(xiàn)。但是，足底注射sPD1 能很快誘發(fā)自發(fā)性疼痛和機(jī)械性觸誘發(fā)痛，且導(dǎo)致條件性位置偏好（CPP，作為持續(xù)性疼痛檢測指標(biāo)）。然而，免疫指標(biāo)不受sPD1 的影響。在坐骨神經(jīng)注射PD1 siRNA 能下調(diào)DRG 神經(jīng)元PD1 表達(dá)，并誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠出現(xiàn)自發(fā)性疼痛和機(jī)械性觸誘發(fā)痛。因而PD1 的表達(dá)足以掩蓋黑色素瘤的癌痛。用nivolumab 和RMP1-14 靜脈注射后，黑色素瘤小鼠出現(xiàn)自發(fā)性疼痛和機(jī)械性觸誘發(fā)痛。SSG 阻斷PD1 下游的信號也使黑色素瘤小鼠出現(xiàn)自發(fā)性疼痛。這些發(fā)現(xiàn)提示PDL1 經(jīng)PD1 和SHP 來掩藏未轉(zhuǎn)移的黑色素瘤的癌痛。 總 結(jié) 目前盛行的觀點(diǎn)認(rèn)為，在癌癥微環(huán)境中的促疼痛介質(zhì)能激活或敏化初級傳入神經(jīng)元。本文闡明了癌組織也能產(chǎn)生對抗疼痛的介質(zhì)PDL1。PDL1 不僅由黑色素瘤組織產(chǎn)生，還能由非癌組織產(chǎn)生，如皮膚、DRG、脊髓。正常小鼠外源給予PDL1 能鎮(zhèn)痛，但阻斷內(nèi)源性PDL1 和PD1 能致痛。PDL1 能抑制急性炎癥性疼痛，也能通過外周和中樞作用減輕神經(jīng)病理性疼痛和骨癌痛。本研究還證明PDL1 是一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)，它經(jīng)PD1 調(diào)節(jié)小鼠和人類DRG 神經(jīng)元興奮性以及脊髓部位的突觸傳遞。形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)證實(shí)小鼠和人類DRG神經(jīng)元上有PD1 表達(dá)，而且有功能。機(jī)制上，小鼠和人類DRG 神經(jīng)元上PD1 被PDL1 激活后抑制動作電位和瞬時鈉電流。PDL1 經(jīng)PD1 和SHP以及TREK2 來調(diào)節(jié)RMPs、導(dǎo)致超極化。在脊髓部位，PDL1 抑制痛覺神經(jīng)環(huán)路中脊髓II 外層神經(jīng)元的sEPSCs。PDL1 還能減輕骨癌誘發(fā)的脊髓背角WDR 神經(jīng)元的過度興奮。這些都說明PDL1 作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)疼痛敏化。由于PDL1 影響sEPSCs 的頻率和振幅，因而PD1 還可能存在于脊髓和腦的突觸后神經(jīng)元上。考慮到膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛病理中的重要作用，也不能排除PDL1和PD1 在慢性疼痛狀態(tài)下調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞功能。值得注意的是，PDL1 抑制病理性疼痛，不僅包括炎癥性、神經(jīng)病理性以及骨癌性疼痛模型，也包括黑色素瘤模型。而且PDL1/PD1 軸在掩蓋黑色素瘤小鼠疼痛中起重要作用。這些研究發(fā)現(xiàn)提醒醫(yī)生，患有黑色素瘤或其他惡性腫瘤的病人需要在免疫治療前中后檢查病人的疼痛狀況。也提醒科研工作者，研究癌細(xì)胞釋放某些特定的疼痛抑制物將為未來疼痛治療提供新的途徑，PDL1/PD1 信號通路可能是其中之一。 海得康發(fā)掘國際新藥動態(tài)，為國內(nèi)患者提供全球已上市藥品的咨詢服務(wù)，如丙肝新藥印度吉三代、肝癌新藥印度多吉美、PD1、PDL1、肺癌AZD9291等，幫助國內(nèi)患者選擇更新更有效的治療藥物和手段，更多藥品信息及購藥渠道，詳詢：400-001-9763,010-67385800，微信：headkonhdk m.jwxr.com.cn |
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