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時間：2017-07-06 作者：pd1 【轉載】 嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法是治療血液惡性腫瘤，如急性B淋巴細胞白血病（B-ALL）的一種創新型療法。然而，這種類型的治療并不能成功治愈實體瘤。最近，一篇發表在J immunotherapy cancer上文章報告了假設腫瘤微環境（TME）的免疫抑制性影響并改變過繼免疫治療的療效,在小鼠模型中探究是否其可以成為增強CAR T細胞功效的策略和可能的組合方法，和這些方法的轉化潛力的研究。 背景 過繼性免疫細胞治療（ACT）是一種新型抗癌工具。已有證據顯示，表達嵌合抗原受體（CAR）的T細胞具有顯著的臨床療效，能夠改善多數血液惡性腫瘤患者的結局。CAR是由細胞外結合結構域，跨膜區和細胞內信號/激活結構域組成的合成分子。細胞外成分由衍生自抗體單鏈可變區片段（scFv）的輕鏈和重鏈區組成，以獨立于MHC的方式識別并結合特異性腫瘤相關抗原（TAA）。 鉸鏈區通常衍生自CD8或IgG4分子，其用以連接細胞內和細胞外成分。最后一部分由觸發T細胞激活的CD3ζ片段組成。第一代CAR載體僅有CD3ζ結構域。第二、三代除CD3ζ結構域外，各增加1-2個共刺激結構域（CD28和/或4-1BB）（圖1）。所有這些成分通常使用γ-逆轉錄病毒或慢病毒轉導系統插入。 圖1. CAR結構。所有不同代的CAR均由胞外抗原結合結構域（通常衍生自抗體單鏈可變片段（scFv）），鉸鏈區，跨膜結構域和各種細胞內結構域組成。第一代CAR，CD3ζ是唯一的信號結構域。第二代CAR增加了一個共刺激結構域，而第三代CAR包含CD28和4-1BB兩次共刺激信號結構域。 眾所周知，其他組織會發生LTR驅動轉基因沉默，但是某項人淋巴細胞研究卻未見載體沉默。有趣的是，一項研究表明，CAR T細胞的體內療效，即CAR表達濃度的特性對抗腫瘤療效以及全身和腫瘤部位CAR T細胞的持久性產生重大影響。 嵌合TCR分子在T細胞中的表達可以避開HLA限制，具有高特異性和強效激活能力，已成為最具前景的癌癥治療方法之一。然而，CAR T細胞在B細胞惡性實體腫瘤中產生的療效卻不盡如人意。阻礙CAR T細胞療法應用于實體瘤治療的問題有三：（1）腫瘤相關抗原的識別；（2）過繼性轉移細胞至腫瘤部位的運輸受限；以及（3）腫瘤微環境的免疫抑制作用。本文將重點介紹第三個問題的解決方案（圖2）。 圖2. 靶向腫瘤微環境中的不同成分以提高CAR T細胞治療的療效。克服TME抑制作用的成果包括靶向免疫抑制群體（即PGE2），基質細胞，細胞因子網絡以及免疫檢查點信號策略 復雜多樣的腫瘤微環境在腫瘤的發生發展和治療耐受中發揮重要作用。最新研究強調了先天免疫激活對引導機體產生腫瘤相關抗原和抗腫瘤活性自發性T細胞免疫應答的重要性，Woo教授及其同事表示，胞漿DNA傳感，I型IFN介導的STING通路激活是維持T細胞腫瘤炎癥表型的主要參與者之一，而腫瘤炎癥表型是免疫治療反應的有利標志。 STING通路激活有助于Batf3依賴的樹突狀細胞活化，這可能是抗腫瘤免疫的核心。活化的樹突細胞由趨化因子誘導至腫瘤部位，然后遷移至次級淋巴器官，并與CD8+T細胞相互作用。克隆擴增后，T細胞遷移回腫瘤微環境，并殺傷腫瘤細胞。 盡管尚未對先天免疫激活劑以及含CAR-T細胞的腫瘤炎性微環境進行徹底評估，但是從效應T細胞功能水平而言，拋開抗原呈遞，腫瘤微環境對CAR-T細胞效應的調節作用應該是顯著的。 此外，CAR T細胞在實體腫瘤瘤內膨脹性生長程度和持久性方面的臨床療效尚未確定。接下來，我們將探討腫瘤微環境抑制免疫反應效應的各個方面，最新研發的一些改變腫瘤微環境，提高CAR T細胞治療療效的方法；其中某些方法可能有助于增強腫瘤對其他類型免疫治療的敏感性。 實際上，盡管本文的重點是CAR T細胞，但是文中探討的許多原理也適用于更廣泛的過繼性細胞療法，如腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）和TCR基因工程T細胞。 靶向缺氧，營養不足和代謝 缺氧和營養不足是腫瘤微環境的主要特征。營養缺乏，尤其是氨基酸，如色氨酸，能夠激活調節T細胞活性的綜合應激反應。吲哚胺2,3雙加氧酶（IDO）是一種細胞內酶，可以催化色氨酸降解為犬尿氨酸。腫瘤微環境內的腫瘤細胞和骨髓細胞均可以表達IDO，導致T細胞增殖和存活受阻。 近年來，Ninomiya教授及其同事證實，IDO表達也可以抑制CAR T細胞。特別地，他們表示，CD19 CAR T細胞無法控制CD19+ IDO表達的腫瘤進展。犬尿氨酸積累會抑制CAR T細胞擴增，細胞毒性和細胞因子的分泌，這表明IDO陽性耐藥腫瘤可能存在這種機制。 有趣的是，他們表示，氟達拉濱和環磷酰胺可以減少IDO表達，進而改善CAR T細胞治療功效。CAR T細胞聯合IDO抑制劑用藥可能是化療和免疫治療無效的惡性腫瘤患者的重要選擇。 另外，腫瘤微環境的代謝應激可能能夠調節T細胞代謝，分化和效應功能。事實上，腫瘤浸潤淋巴細胞修飾自身代謝是對缺氧作出的反應，這也是實體瘤的特征。 而耐人尋味的是，共刺激結構域不同的CAR T細胞代謝途徑不同，這反過來也說明了腫瘤微環境的可變持續性。 Kawalekar教授及其同事開展的研究表明，相較于攜帶有CD28信號結構域的CAR T細胞，4-1BB CAR T細胞提高了線粒體的生物合成，促進中央記憶表型CAR T細胞的生成，具有生存優勢。相較之下，CD28-CAR T細胞可以產生效應記憶表型，增強糖酵解作用。 這項研究強調了工程T細胞在免疫抑制腫瘤微環境中存活和衰竭設計的意義。 改變腫瘤微環境中的代謝成分只是使CAR T細胞潛能最大化釋放的一種可能性。Newick博士及其同事開展的關于抑制蛋白激酶A（PKA）的最新研究得出了相似結論。 PKA是腫瘤微環境中產生的另外兩種免疫抑制因子：前列腺素E2（PGE2）和腺苷的下游效應子。不同的研究顯示，以上兩種免疫抑制因子能夠有效抑制T細胞的增殖和活化。 研究人員通過正在表達的RIAD（調節I亞基錨定干擾物）肽干擾PKA對脂伐的錨定。RIAD肽能夠取代PKA和ezrin蛋白的關系，與腺苷酸環化酶緊密結合，合成一種必需蛋白質。 相較于間皮素導向的CAR T細胞，間皮素導向的CAR-RIAD T細胞在體內表現出更高的浸潤性，持久性和抗腫瘤活性。另外，RIAD表達導致趨化反應增強，受CXCR3表達的影響，具有更好的粘附性。隨著這種方法轉化為臨床試驗，RIAD肽的免疫原性可能成為一個問題。 另外一種可改變腫瘤微環境的方法是通過促進內源性免疫應答募集，增強CAR T細胞抗腫瘤反應。Curran教授及其同事已經通過CAR T細胞CD40L組成型表達驗證了這一方法。 他們表示，該策略改善了CAR T細胞毒性，降低了PD-1表達，改善了CD40陽性濾泡淋巴瘤系統模型中DC抗原的呈遞功能。這些機制可能與Gajewski博士及其同事所述的STING通路一致（如上）。 因此，靶向腫瘤免疫抑制群體，如PGE2和/或T細胞，改變腫瘤微環境的反應是提高免疫治療功效的好機會。 靶向基質 靶向非惡性癌癥相關的基質細胞（CASC）也可以增強抗腫瘤免疫治療的功效。這些細胞可以分泌促進腫瘤生長，轉移和血管生成的生長因子，細胞因子和趨化因子。其中最受關注的基質是成纖維細胞激活蛋白（FAP），這是一種參與90%以上上皮癌細胞外基質重塑，并由CASC選擇性表達的絲氨酸蛋白酶。三個不同組的患者使用FAP CAR T細胞治療后顯示出明顯差異。 Tran教授及其同事發表的文章表明，盡管由于體外抗原刺激，FAP CAR能夠特異性脫顆粒，并產生效應細胞因子，但是它們并不能介導體內有效的抗腫瘤反應，甚至令人震驚的是，抗FAP CAR能夠誘發嚴重惡病質和致命骨毒性。 作者發現FAP蛋白也由多能骨髓基質細胞（BMSC）表達，該表達與觀察到的毒性有關。然而，Kakarla教授及其同事設計的人類肺癌小鼠模型顯示，攜帶有不同scFv的FAP-CAR具有無毒性抗腫瘤功效。即使T細胞持久性受限，聯合注射FAP特異性和腫瘤特異性T細胞也可以實現緩解。 Schuberth教授及其同事研發了一種適用于異種移植間皮瘤內FAP-CAR的過繼性轉移的腹膜內模型。他們掌握的數據顯示生存率增加；然而，抗人FAP scFv與小鼠FAP沒有發生交叉反應，這使脫靶效應的評估受到局限。 Wang教授及其同事發表的一篇論文表明，靶向FAP陽性細胞通過表位擴展增強抗腫瘤免疫。他們發現，免疫同系小鼠間皮瘤和肺癌模型抗FAP CAR治療三天后，內源性CD4+T細胞活化，隨后內源性CD69+，INFγ+CD8+ T細胞浸潤數量增加。 免疫缺陷小鼠不發生抗腫瘤反應，這表明適應性免疫系統的重要性。此外，他們發表的另一篇文章表明，具有FAP抑制相關性的同一組模型也具有免疫獨立抗腫瘤作用。Lo教授及其同事采用弱免疫原性和高度增生的腫瘤，胰腺導管腺癌開展的研究證實，FAP-CAR T細胞抑制了腫瘤的形成，降低了腫瘤血管密度，干擾了腫瘤細胞的空間取向。 關于可以識別高度陽性FAP細胞，并且攜帶有不同scFv的CAR T細胞的兩項最新研究結果已經相當可靠，因此，Rosenberg教授等人在研究中發現的安全性問題可能與scFv的特異性和親和力有關。 多模態靶向FAP具有抗腫瘤潛力，未來合理且有趣的免疫治療方法組合包括抗基質CAR T細胞結合抗腫瘤CAR T細胞或檢查點阻斷治療。 除靶向FAP外，運用CAR T細胞治療基質豐富型腫瘤的另外一種最新策略是靶向乙酰肝素酶（HPSE）。HPSE負責硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HPG）的降解，這是T細胞向腫瘤部位運輸和聚集的基本過程。 Caruana教授及其同事表示，加工過程中，CAR T細胞失去了HSPE表達，導致降解細胞外基質能力下降，影響CAR T細胞遷移。作者表示，異種移植神經母細胞瘤模型中，HSPE表達促進了腫瘤浸潤，改善了存活率。 靶向細胞因子網絡 塑造腫瘤微環境以提高ACT功效的另一種可能選擇是誘導局部釋放促進抗腫瘤免疫反應的刺激因子。在此前提下，白細胞介素-12（IL-12）和IL-18是具有前景的刺激因子。IL-12是一種炎性細胞因子，能夠促進T細胞活化，誘導Th1 CD4 + T細胞應答，CD8 +克隆擴增，以及效應功能。 此外，它還能夠將NK細胞募集至腫瘤部位，成為腫瘤相關巨噬細胞，重新激活無能的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），抑制調節性T細胞，并分泌IL-10, IL-4和β轉化生長因子（TGFβ）。基于以上理論，幾個研究小組研發了IL-12分泌與CAR表達相結合的“第四代”CAR T細胞。 Koneru教授及其同事[40]將所謂的“通用細胞因子殺傷重定向T細胞(TRUCK)”應用于正交異位卵巢腫瘤移植模型治療。他們發現，(TRUCK)能夠完全根除腫瘤，延長CAR T細胞的持久性，提高全身IFNγ水平。 為提高組成型，全身高水平IL-12的安全性，降低其不必要的毒性，Koneru教授及其同事研發了一種編碼MUC-16ecto抗原特異性scFv，IL-12以及截斷EGFR消除基因（EGFRt），并且可以局部施用的三順反子表達載體。 相較于靜脈給藥，CAR T細胞腹腔給藥療效更顯著。本文為確定此種方法安全性和可行性的，鉑耐藥卵巢癌患者I期臨床試驗奠定了基礎。 CAR中，轉基因有效負荷產生和釋放時，應使毒性降至最低，另外，“關閉”系統，如EGFRt為安全性提供了額外的控制措施。 此外，IL-12表達對來自臍帶血（UCB）的CAR T細胞的生成和功效非常重要。Pegram教授及其同事[43]引進了一種新型UCB T細胞擴增和遺傳修飾技術。 首先，他們證實，向培養的活化UCB T細胞中加入IL-12和IL-15，可以使其150倍擴增，并具有記憶性和效應標志物理想表型。 其次，抗CD19 CAR載體中IL-12表達能夠在不需要預處理或Il-2輔助的情況下，顯著提高急性淋巴細胞白血病（ALL）小鼠的存活率。 這些數據支持運用ACT，進一步增強高危，復發/難治性ALL UCB移植患者移植物抗白血病效應的臨床轉化。 另外一種調節腫瘤微環境信號的可行性策略是直接抑制TGFβ，IL-10，和/或IL-4信號。眾所周知，腫瘤細胞和腫瘤相關細胞分泌第一個分子是腫瘤免疫逃逸的一個機制，而IL-10和IL-4是有效的免疫抑制細胞因子。 基于此的一種方法是強制T細胞表面過表達顯性負性受體。張教授及其同事在黑色素腫瘤模型中發現，TGFβ DNRII過表達的T細胞在體內和體外的抗腫瘤功效增強。盡管已經取得了前瞻性的結果，但是我們必須進行進一步研究以驗證CAR T細胞治療背景下這一方法的有效性。最近，Mohammed教授及其同事研發了一種用于以IL-4水平升高為特征的前列腺癌治療系統。 這種系統由反轉細胞因子受體（ICR）組成。具體而言，該4/7ICR由與IL-7細胞內免疫刺激結構域結合的抑制性IL-4受體細胞外結構域組成。第一代抗PSCA CAR載體和ICR共表達導致體外和體內抗腫瘤活性增加。 這種方法將T細胞信號轉化為刺激性信號，同時剝奪了癌細胞的重要生長因子。第二代CAR與4/7 ICR組合可以改善這些結果。 靶向免疫檢查點 腫瘤微環境發揮免疫抑制作用的主要機制是誘導表面抑制性受體，如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）和程序性死亡-1（PD-1）上調。抗原-受體結合后，這些分子會自然上調以抑制組織內T細胞活化，維持外周耐受。 更好地了解腫瘤微環境各種內在抑制通路的活化機制可以成功進行免疫檢查點治療。此外，最新研究揭示，PD-1在人類細胞衰竭過程中起著關鍵作用。John教授及其同事[47]發表了首個“CAR T細胞表達PD-1，并易受PD-A介導的抑制”概念驗證研究。 作者表示，采用CAR T細胞和抗PD-1抗體治療Her2+荷瘤小鼠時，其抗腫瘤活性改善。奇怪的是，腫瘤明顯消退時，腫瘤微環境中髓源性抑制性細胞（MDSC）卻在減少。然而，抗腫瘤活性增加機制及MDSC的調節作用仍有待證實。 Moon教授及其同事后續開展的一項研究證實，間皮瘤模型中，CAR TILs表面PD-1表達增加與其功能缺失有關。通過阻斷PD-1，恢復了體外間皮瘤CAR T細胞的細胞毒性。除了施用免疫檢查點抗體外，阻斷免疫檢查點的另一種方法是采用基因工程策略。 例如，劉教授及其同事將PD1：CD28開關受體插入CAR載體。該受體由Prosser等人研發，旨在表達融合CD28跨膜區和信號結構域的PD-1細胞外結構域；該構建體與內源性PD-1競爭，發揮顯性陰性模型的作用，和/或與PD-1結合后，通過細胞質結構域主動發出信號。作者分析了靜脈滴注PD1:CD28 CAR T細胞在大型，已確定的實體腫瘤，如異種移植模型中的間皮瘤和前列腺癌治療中的功效。 他們表示，腫瘤和外周血中CAR TILs分泌頻數顯著增加，離體抗腫瘤功能更大，分泌更多細胞因子。有趣的是，運用具有突變信號結構域的開關受體可以消除這些結果，這說明CD28共刺激結構域在融合構建體中發揮主要作用。 相反，Cherkassky教授等人證實，間皮瘤異種移植模型中，CAR T細胞與PD-1的“顯性陰性”表達結合具有更強的持久性，可以增強抗腫瘤作用，延長存活率。該模型中PD-1“顯性陰性”形式僅由PD-1細胞外結構域（無信號結構域）組成，其可能與內源性PD-1競爭結合PD-L1。產生以上結果的一個可能原因是經治療腫瘤的類型不同。 另外，Cherkassky教授及其同事表示，相較于包含CD28信號區域的CAR T細胞，較低劑量具有4-IBB共刺激結構域的CAR T細胞即可發揮功效，并且其抗PD-1介導的細胞衰竭能力更強。 其他腫瘤模型也表明，PD-1介導的CAR T細胞抑制是一種普遍的抑制機制，尤其是具有免疫活性的小鼠模型。了解嵌入CAR的共刺激結構域的作用及其介導抗抑制分子和抗CAR T細胞衰竭的不同機制也很重要。 盡管尚未確定最具安全性和有效性的檢查點組合，但是這些臨床前數據證明，免疫檢查點阻斷與CAR T細胞結合是改善CAR T細胞治療患者臨床結局的合理治療策略。 海得康發掘國際新藥動態，為國內患者提供全球已上市藥品的咨詢服務，如丙肝新藥印度吉三代、肝癌新藥印度多吉美、PD-1、PD-L1、肺癌AZD9291等，幫助國內患者選擇更新更有效的治療藥物和手段，更多藥品信息及購藥渠道，詳詢：400-001-9763,010-67385800，微信：headkonhdk 。 |
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