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時(shí)間：2017-05-08 作者：吉三代 目的:這項(xiàng)研究的目的是探討第一代、第二代和第三代表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑序貫治療的療效和在這些抑制劑的連續(xù)使用獲得性耐藥的機(jī)制。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):我們開發(fā)了一個(gè)獲得抗表皮生長因子受體抑制劑的治療裸鼠異種移植HCC827細(xì)胞株模型, ,人類非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞株存在表皮生長因子受體激活突變,序貫的第一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)(埃羅替尼、吉非替尼)的第二代EGFR-TKI(阿法替尼)+ / - anti-EGFR單克隆抗體西妥昔單抗,和第三代EGFR-TKI(奧希替尼)。 結(jié)果:HCC827衍生的異種移植和獲得性表皮生長因子受體抑制劑耐藥對(duì)序貫使用第一、第二代和第三代EGFR-TKIs敏感。順序第一代EGFR抑制劑耐藥接著阿法替尼治療+ / -西妥昔單抗,再次是奧希替尼,在這個(gè)模型代表一個(gè)有效的治療策略。而T790M耐藥突變沒有被檢測,獲得性耐藥的主要機(jī)制是Hedgehog (Hh)通路組件的激活。這種現(xiàn)象是伴隨著EMT。體外建立細(xì)胞系從吉非替尼耐藥或afatinib耐藥或奧希替尼耐藥的腫瘤顯示轉(zhuǎn)移特性和保持EGFR-TKIs，選擇SMO抑制劑sonidegib抑制Hh聯(lián)合EGFR-TKI逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥,。 結(jié)論:EGFR突變NSCLC可以受益于序貫的表皮生長因子受體抑制劑治療,與耐藥機(jī)制無關(guān)。在復(fù)雜和異質(zhì)的情況下,顯示Hh是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)抗表皮生長因子受體抑制劑耐藥和誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的因子。 EGFR突變持續(xù)EGFR抑制NSCLC的治療效果。 裸鼠異種移植EGFR 19del HCC827,使用第一代EGFR-TKIs序列(埃羅替尼、吉非替尼)(步驟1),第二代EGFR-TKIs(阿法替尼)+ / -西妥昔單抗,抗EGFR單克隆抗體(步驟2)和第三代EGFR-TKIs(奧希替尼,AZD9291)(步驟3)(圖1)。
在第一步中, 兩組各5只HCC827老鼠使用埃羅替尼/吉非替尼逐步升級(jí)的劑量治療 6個(gè)月獲得埃羅替尼或吉非替尼耐藥的腫瘤細(xì)胞。監(jiān)測腫瘤對(duì)治療的反應(yīng),我們使用一個(gè)任意分類方法測量體積變化:完全緩解(CR)被定義為沒有腫瘤的臨床證據(jù)在小鼠犧牲后;局部反應(yīng)(PR)被定義為至少30%腫瘤體積的減少相比基線腫瘤體積,疾病進(jìn)展(PD)被定義為增加至少20%的腫瘤體積相比基線腫瘤體積;獲得性耐藥指比腫瘤治療后最小時(shí)增加> 25% 再生長;既不足夠減少也不足夠增加被視為穩(wěn)定 (SD)。這一標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,顯示埃羅替尼及吉非替尼治療HCC827異種移植腫瘤的效果,導(dǎo)致初始劑量依賴性減少腫瘤體積和隨后的7/10腫瘤獲得性耐藥的進(jìn)展和約60%響應(yīng)率(RR（有效率）,PR和CR),其中包括一個(gè)吉非替尼治療CR反應(yīng),持續(xù)了6個(gè)月,平均響應(yīng)時(shí)間5周. 分析二線治療最佳治療選擇,在第二步中, 第一代EGFR-TKIs耐藥7人每個(gè)腫瘤被重新移植到2個(gè)新的老鼠和隨機(jī)阿法替尼升級(jí)劑量治療或西妥昔單抗+阿法替尼，總共14小鼠在步驟2。二線藥物治療開始之前,我們進(jìn)行了為期一周使用各自的第一代EGFR-TKIs確認(rèn)持久耐藥性。阿法替尼治療導(dǎo)致PR 5/7,CR 1/7和1/7迅速PD, 阿法替尼+西妥昔單抗治療CR 4/7，PR4/7,RR為100%。只有一個(gè)腫瘤，最初對(duì)聯(lián)合治療反應(yīng)靈敏，顯示出迅速獲得耐藥。阿法替尼和阿法替尼+西妥昔單抗CR反應(yīng)持續(xù)了超過6個(gè)月。所有5只阿法替尼治療PR的小鼠經(jīng)過平均7周的時(shí)間后進(jìn)展。類似于第一步,異種移植的腫瘤樣本分析,進(jìn)行體外培養(yǎng)和重移植。 選擇阿法替尼治療耐藥進(jìn)展可能使用標(biāo)準(zhǔn)化療或第三代表皮生長因子受體抑制劑。因此,在第三步中,我們決定重新移植5個(gè)阿法替尼獲得性耐藥腫瘤以及一個(gè)阿法替尼 +西妥昔單抗聯(lián)合治療的獲得性耐藥腫瘤。每個(gè)腫瘤被重新移植2個(gè)新的老鼠隨機(jī)采用常規(guī)化療和劑量逐步升級(jí)奧希替尼治療。類似于前面的步驟,重新移植后進(jìn)行一周治療以確認(rèn)腫瘤阿法替尼或阿法替尼+西妥昔單抗的持續(xù)耐藥。同樣治療結(jié)束后收集異種移植腫瘤樣本進(jìn)行分子分析和建立體外細(xì)胞培養(yǎng)。雖然7人沒有1人EGFR-TKIs耐藥發(fā)生T790M突變,奧希替尼治療帶來71%的緩解率RR(包括一個(gè)CR維持超過10周,4/7 PR)。獲得耐藥性的發(fā)展發(fā)生在治療的7周內(nèi)。而化療引起的1/7PR兩周內(nèi)快速發(fā)展的耐藥和4/7 SD持續(xù)了不到5周。腫瘤耐藥前阿法替尼+西妥昔單抗,因此適合重移植進(jìn)行第三步的實(shí)驗(yàn),這些腫瘤對(duì)奧希替尼和化療完全耐藥。 收集每一步EGFR-TKIs耐藥腫瘤的DNANGS分析,證明大量驅(qū)動(dòng)突變的代表性細(xì)胞系,分別是EGFR (E746_A750delELREA)和KIT(M541L)突變,從平均等位基因頻率來看，分別為第一代EGFR-TKIs耐藥腫瘤是99%和80%,第二代阿法替尼或阿法替尼+西妥昔單抗是97%和70%,97%和97% ，第三代奧希替尼是98%和66%。所有老鼠樣本經(jīng)歷獲得耐藥突變都不存在T790M突變。我們沒有檢測到新的突變的發(fā)生除一個(gè)等位基因頻率高于2%外，還有一個(gè)腫瘤對(duì)吉非替尼-阿法替尼-奧希替尼耐藥產(chǎn)生 KRAS-G12D突變的等位基因頻率檢測是8 5%。 第一代、第二代和第三代EGFR抑制劑獲得性耐藥一個(gè)常見信號(hào)是Hedgehog通路激活。 免疫印跡分析第一代、第二代和第三代獲得性耐藥腫瘤蛋白質(zhì)提取物，顯示Hh通路的兩個(gè)關(guān)鍵組件的水平逐步增加與未經(jīng)處理的對(duì)照的大多數(shù)腫瘤樣品相比,Smoothened(SMO) 一個(gè)7次跨膜蛋白受體,GLI1,主要的轉(zhuǎn)錄因子。 EMT激活明顯只有在第一代EGFR-TKIs耐藥的腫瘤樣本,而所有耐藥腫瘤顯示波形蛋白過度表達(dá)表明間充質(zhì)屬性的獲得。其他的受體,如AXL,ERBB2,沒有顯示活性增加。這些結(jié)果證實(shí)了Hh信號(hào)通路是第一代EGFR-TKIs獲得性耐藥的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子和Hh激活能夠持續(xù)幾代EGFR-TKI治療。 在幾乎所有來自不同的EGFR-TKI耐藥的腫瘤蛋白質(zhì)樣本MAPK磷酸化水平很低,除了gefitinib-afatinib-osimertinib耐藥發(fā)現(xiàn)KRAS-G12D突變。相反,磷酸化AKT蛋白質(zhì)水平在耐藥的腫瘤里升高,表明除非治療期間出現(xiàn)新突變, 在EGFR-TKI耐藥模型存在一個(gè)常見的下游信號(hào)通路被激活。 為調(diào)查Hh和EMT是基因擴(kuò)增的結(jié)果,FISH分析耐藥腫瘤樣本,檢測SMO,EMT。結(jié)果是兩個(gè)基因的基因拷貝數(shù)了相似在耐藥與未耐藥樣本。 癌癥細(xì)胞培養(yǎng)體外研究來自吉非替尼/厄洛替尼-阿法替尼-奧希替尼耐藥腫瘤異種移植。研究在是否存在EGFR-TKIs情況下增加Hh通路組件表達(dá)的功能性意義，通過調(diào)查抑制SMO,使用選擇性SMO拮抗劑sonidegib對(duì)細(xì)胞生存和凋亡的影響。 三個(gè)主要的培養(yǎng)樣本選擇每個(gè)步驟耐藥的腫瘤(吉非替尼耐藥, 阿法替尼耐藥, 奧希替尼耐藥)。sonidegib(1 mmol/L)沒有顯著影響腫瘤細(xì)胞的生存活性。分別與各代EGFR-TKI聯(lián)合治療 sonidegib顯著抑制細(xì)胞增殖。耐藥腫瘤細(xì)胞顯示波形蛋白的表達(dá)增加,表明這些細(xì)胞經(jīng)歷了EMT。因此,我們體外評(píng)估這些EGFR-TKI耐藥細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中侵犯，遷移,形成殖民地的能力,。耐藥細(xì)胞顯示高轉(zhuǎn)移性能力沒有受到各代EGFR-TKI存在的影響。因此,我們調(diào)查了單獨(dú)或聯(lián)合EGFR-TKI抑制SMO細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移性屬性。例如,EGFR-TKIs耐藥細(xì)胞遷移能力在各代EGFR-TKI與 sonidegib聯(lián)合治療下明顯降低,吉非替尼耐藥細(xì)胞降低12%,和吉非替尼-阿法替尼和吉非替尼-阿法替尼-奧希替尼耐藥細(xì)胞降低25%。細(xì)胞增殖、入侵和不依賴貼壁增長能力也是同樣結(jié)果。 有趣的是，有兩種耐藥模型激活特殊的機(jī)制。只有一個(gè)腫瘤對(duì)阿法替尼+西妥昔單抗耐藥,然后也對(duì)奧希替尼和化療耐藥, 在奧希替尼治療后顯示AXL連同SMO一起激活。在三代EGFR-TKI治療耐藥后PD-L1蛋白質(zhì)水平逐漸升高。因此,從這個(gè)奧希替尼耐藥細(xì)胞系建立體外腫瘤異種移植用于測試聯(lián)合抑制AXL,使用foretinib,SMO,使用sonidegib,研究存在與不存在奧希替尼的情況下耐藥細(xì)胞增殖,遷移和侵犯能力。Foretinib比sonidegib產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制，然而sonidegib+Foretinib+奧希替尼顯著抑制癌細(xì)胞的生長能力。 另一個(gè)特定的情況是由吉非替尼-阿法替尼-奧希替尼治療獲得性耐藥出現(xiàn)KRAS-G12D突變。對(duì)這個(gè)腫瘤蛋白質(zhì)分析顯示下游通路增加MAPK磷酸化。因?yàn)檫@個(gè)原因我們也決定測試MEK抑制劑司美替尼（AZD6244）活性,單獨(dú)或聯(lián)合司美替尼治療。而司美替尼單藥治療產(chǎn)生適度抑制細(xì)胞增殖,聯(lián)合司美替尼強(qiáng)烈抑制癌細(xì)胞生存。
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